В 1865 Бекетов защитил докторскую диссертацию Исследования над явлениями вытеснения одних металлов другими, в 1866 был избран членом Петербургской академии наук и переехал в Петербург. Работал в химической лаборатории Петербургской академии наук, преподавал на Высших женских курсах.

В 1860 Бекетов начал читать курс лекций по физической химии в Харьковском университете, в 1864 организовал отделение по подготовке физико-химиков. В докладной записке, обосновывавшей создание новой специальности, Бекетов писал: «Знать химию... невозможно без основательного знакомства с физикой, а потому также с математикой... Хотя мы и различаем химические и физические свойства тел, и те и другие суть выражение строения и свойств малейших частиц... Строение материи... находится в зависимости от физических условий и химических свойств».

Научные работы Бекетова посвящены изучению зависимости направления химических реакций от состояния реагентов и внешних условий, исследованию химического сродства и того, какими свойствами это сродство определяется. В своей докторской диссертации он установил роль концентраций реагентов для направления химической реакции, предвосхитив выводы закона действующих масс. Открыл вытеснение металлов из растворов их солей водородом и показал, что химическое действие газов зависит от давления; установил возможность протекания реакции в двух направлениях и дал точное определение состояния равновесия. Исследовал вытеснение одних элементов другими из их соединений и связал эти процессы с «первоначальными химическими свойствами элементов – тем, что называется химическим сродством». Стремясь связать химические явления с «относительными массами и расстояниями между действующими частицами», Бекетов вплотную подошел к идее, что химические свойства веществ определяются свойствами их атомов – атомной массой и радиусом. Установленный им «вытеснительный ряд металлов» в точности совпал с найденным впоследствии электрохимическим рядом напряжений. Исходя из своих представлений о «прочности» (в современной терминологии – стабильности) соединения элементов с близкими атомными массами, Бекетов предложил в качестве наиболее сильного восстанавливающего агента алюминий. С его помощью осуществил восстановление некоторых металлов из их оксидов при высоких температурах, создав основы метода, позже вошедшего в практику под названием алюминотермии. Этот метод теперь широко используется в металлургии.

Бекетов был не только ученым и педагогом, но и общественным деятелем: организовал публичную библиотеку в Харькове, Общество по распространению грамотности и Общество пособия нуждающимся студентам, выступал с публичными лекциями. Был президентом Русского физико-химического общества.

Умер Бекетов в Петербурге 13 декабря 1911.

Бекетов Н.Н. Воспоминания химика о пережитом наукою в XIX столетии. – Журнал Русского физико-химического общества, 1901, № 33
Беляев А.И. Николай Николаевич Бекетов – выдающийся русский физико-химик и металлург. М., 1953