По преданию основан печерскими иноками, бежавшими на Волынь от Батыя и поставившими здесь Успенскую церковь. Ко времени основания относят явление Богоматери, оставившей след в виде «Стопы Почаевской» (отпечаток ноги на известковом туфе). В 1597 помещица Анна Гойская перенесла сюда почитавшуюся чудотворной икону Богоматери и наделила монастырь землевладениями. Среди настоятелей обители наиболее известен Иов (Желизо; ум. 1651), причисленный к лику святых. Долгое время находясь в составе польско-литовского, преимущественно католического государства, монастырь оставался православным, однако уже после присоединения Украины к России, в процессе усиления влияния Ватикана в западнославянских землях, был в 1720 обращен в униатский. К этому периоду относятся наиболее значительные сооружения, связанные с благотворительностью графа Н.Потоцкого. После того как монахи-униаты поддержали польское восстание 1831, император Николай I передал монастырь в ведомство православной епархии, а в 1833 его сделали лаврой.

Издалека виден монументальный Успенский собор (1771–1791), выстроенный в стиле австрийского барокко по проекту архитектора П.Г.Гофмана; здесь расположены главные святыни – рака с мощами преподобного Иова и «Стопа» с источником. Архитектурно выделяются также трапезная того же времени и стиля, классицистическая колокольня (1861) и Троицкий собор (1906, архитектор А.В.Щусев, наружная мозаика Н.К.Рёриха).

Находясь в составе Польши после Октябрьской революции, а позднее – на территории, оккупированной немцами, лавра не раз становилась центром движения за автокефальную украинскую церковь. После войны Русской православной церкви удалось отстоять обитель от закрытия (оно представлялось неминуемым, когда здесь в 1959 открыли Музей атеизма, который должен был занять весь комплекс).