По окончании университета Буслаев преподавал русский язык в гимназиях Москвы и давал частные уроки. В эти годы начал публиковать научные труды по методике преподавания русского языка (О преподавании отечественного языка, 1844, и др.). Будучи домашним учителем в семье графа Строганова, в 1839–1841 жил в Германии и Италии, изучал труды по языковедению и истории В.Гумбольта и Я.Гримма, а также археологию и историю европейского искусства.

В 1847 преподаватель, с 1859 – профессор Московского университета. Впоследствии был избран действительным членом Российской Академии наук. В 1850-е годы писал как труды по языкознанию (Опыт исторической грамматики русского языка, 1858, и др.), так и рецензии на произведения современных ему писателей – К.Аксакова, А.Хомякова и др. В центре его научных интересов находились проблемы изучения диалектов, связи истории языка с историей страны. Публиковал в печати многочисленные статьи на эти темы – Об эпических выражениях украинской поэзии (1850), О народности в древне-русской литературе и искусстве (1857), Песни древней Эдды о Зигурде и муромская легенда (1858) и др.

В 1861 издал труд Историческая хрестоматия церковнославянского и древнерусского языков. В Хрестоматию вошли 135 произведений, некоторые были подготовлены к печати по рукописям и опубликованы впервые. В том же году была опубликована книга Буслаева Исторические очерки русской народной словесности и искусства – яркое свидетельство мифологической школы в русской науке.

Буслаев относил себя к русской школе, приверженцами которой были также А.Н.Афанасьев, А.А.Котляревский и др. филологи. По его мнению, народное мировоззрение, народная мораль проявляются в первую очередь в языке и в мифологии. Народная поэзия, в понимании Буслаева, является нравственным идеалом. Называя «славянофильскую самостоятельность» одной из ложных и вредных для науки крайностей, Буслаев тем не менее считал ее «гораздо достойнее подначального западничанья».

В 1887 Буслаев издал еще один труд – сборник статей Народная поэзия. Исторические очерки. В книгу вошли статьи не только о русской, но и о европейской литературе – Русские духовные стихи (1861), Русский богатырский эпос (1862), Песня о Роланде (1864), Испанский народный эпос о Сиде (1864), Сравнительное изучение народного быта и поэзии (1872) и др. Буслаев считал, что корни европейского фольклора следует искать на Востоке.

В 1860–1870-е годы Буслаев совершил несколько заграничных путешествий – выезжал в Чехию, Германию, Италию, Францию, Швейцарию, где изучал историю искусства. Результатом этих поездок явилась статья Общие понятия о русской иконописи (1866) и др. работы по истории живописи, иконографии, миниатюры, орнамента. Мировую славу принесла Буслаеву книга Русский лицевой апокалипсис. Свод изображений из лицевых апокалипсисов по русским рукописям с XVI в. по XIX (1884), в которой ученый проследил связь между памятниками искусства, литературы и фольклора. Буслаев обнаружил также связь между памятниками искусства Византии, Западной Европы и Древней Руси.

В 1886 издал книгу Мои досуги, в которую вошли статьи о современной ему литературе – о произведениях Н.Карамзина, И.Крылова, М.Погодина и др. писателей, а также работа О значении современного романа и его задачах. Незадолго до смерти завершил работу над мемуарами Мои воспоминания (1890–1892), которые, потеряв зрение, надиктовал. В этой книге Буслаев описал свои детские и студенческие годы, своих великих современников Н.Гоголя, Т.Грановского, П.Чаадаева, И. и П.Киреевских и др.

Умер Буслаев в пос. Люблино под Москвой 31 июля (12 августа) 1897.