Родился близ Ростова Великого, в боярской семье. Обеднев, его родители Кирилл и Мария переселились со своими тремя сыновьями, Стефаном, Варфоломеем и Петром, в Радонеж. Когда родители скончались, приняв перед смертью монашеский постриг, Варфоломей отправился в Хотьково-Покровский монастырь, где уже иночествовал его старший брат Стефан. Уговорив Стефана, пошел искать с ним место для более уединенного, пустынного жития. В глухом лесу, на холме Маковец (где стоит ныне Троице-Сергиева лавра) они построили деревянную келью и церковь, освященную во имя св. Троицы. Стефан вскоре уехал в московский Богоявленский монастырь, Варфоломей же принял (не ранее 1341) постриг. Больше года он пребывал в лесу один, но мало-помалу к нему стали приходить другие монахи, возводя свои кельи. Со временем они убедили его принять над ними игуменство, и он был рукоположен в священники. Запретив принимать подаяние, Сергий поставил правилом, чтобы все иноки жили от своего труда, сам подавая им в этом пример.

Добрая молва о Сергиевой обители привлекала к нему все больше богомольцев и новых послушников, рос поток пожертвований. Рядом возник посад, за ним села. В княжение Дмитрия Донского весть о Сергии дошла до Константинополя, и патриарх Филофей прислал ему грамоту на введение киновии (общежительного устройства). С тех пор киновия, сплачивающая монахов в тесную, разнообразную по обязанностям общину, была принята во многих русских монастырях.

Своим основанием Сергию обязаны и еще целый ряд монастырей (Андроников и Симонов в Москве, Борисоглебский недалеко от Ростова, Старо-Голутвинский близ Коломны и др.); во все эти обители он поставил настоятелями своих учеников. Более 40 монастырей было основано его учениками: Саввой (Саввино-Сторожевский близ Звенигорода), Ферапонтом (Ферапонтов), Кириллом (Кирилло-Белозерский) и др., а также его духовными собеседниками, такими, как Стефан Пермский. Авторитет Сергия был огромен даже по географическим масштабам. Тем не менее, когда митрополит Московский Алексий просил его стать его преемником, преподобный эту почесть отклонил.

Аскет и мистик (мотивы видений и чудес в его житии превосходят своей эмоциональной силой всю предшествующую русскую агиографию), он, тем не менее, выступал и как мудрый политик, стремящийся к умирению раздоров и сплочению русских земель. В 1366 Сергий разрешил княжеский родовой спор за Нижний Новгород, в 1387 выехал послом к Олегу Рязанскому, добившись его примирения с Москвой. Особой славой овеяны его дела и молитвы перед Куликовской битвой (1380). Собираясь идти на Мамая, Дмитрий Донской приехал за благословением к Сергию. Предрекая князю победу, тот также, согласно легенде, послал с ним на брань двух иноков своей обители, Пересвета и Ослябю, погибших в бою.

Скончался преподобный 25 сентября 1392. Мощи его были обретены нетленными в 1422, и в 1452 Сергий был причислен к лику святых. Церковь отмечает память его в день кончины 25 сентября (8 октября), а также 5 (18) июля, в день обретения мощей.

Наиболее известным источником сведений о нем, равно как и замечательным памятником древнерусской словесности является житие Сергия, написанное в 1417–1418 его учеником Епифанием Премудрым, а в середине 15 в. значительно переработанное и дополненное Пахомием Логофетом.